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基因工程(genetic engineering)丨科研绘图_科研绘图公司_科研绘图软件_SCI-HUA科画

发布时间:2019-04-25 13:37
作者:SCI-HUA WiKi


基因工程(英语:genetic engineering,又称为遗传工程转基因基因修饰)是一组使用生物技术直接操纵有机体基因组、用于改变细胞的遗传物质的技术。包括了同一物种和跨物种的基因转移以产生改良的或新的生物体。可以通过使用分子克隆技术分离和复制需要的遗传物质以产生DNA序列,或通过合成DNA,然后插入宿主生物体,以此将新的遗传物质插入宿主基因组中。可以使用核酸酶除去或“敲除”基因。基因靶向是使用同源重组来改变内源基因的不同技术,并且可以用于缺失基因,去除外显子,添加基因或引入点突变。

通过基因工程产生的生物体被认为是转基因生物体(GMO)。第一种转基因生物是1973年产生的细菌和1974年的转基因小鼠。利用细菌产生胰岛素在1982年商业化,转基因食品自1994年以来一直销售。作为宠物设计的第一种转基因生物GloFish于2003年12月首先在美国销售。[1]

遗传工程技术已经应用于许多领域,包括研究、农业、工业生物技术和医学。用于洗衣洗涤剂和药物如胰岛素和人生长激素的酶现在在转基因(GM)细胞中制造,实验性转基因细胞系和转基因动物例如小鼠或斑马鱼正用于研究目的,并且转基因作物已经商业化。

定义


常规植物育种与转基因和顺式基因修饰的比较

遗传工程是改变生物的遗传组成使用的技术,包括了删除可遗传材料,和将生物体外直接制备的DNA导入宿主或细胞,然后与宿主融合或杂交。[4] 这涉及使用重组核酸(DNA或RNA)技术来形成可遗传遗传材料的新组合,然后通过载体系统间接地或通过显微注射,大量注射和微囊化技术直接掺入该材料。

遗传工程通常不包括传统的动物和植物育种、体外受精、多倍体育种、人工诱变和细胞融合技术,因为在该过程中不使用经过重组核酸或遗传修饰的生物体。[4]然而,欧盟也将遗传工程广泛定义为包括选择育种和其他人工选择手段。[5]克隆和干细胞技术,虽然不被认为是遗传工程,[6]但也是与基因工程密切相关的,可以在其中使用基因工程。[7] 合成生物学是一个新兴的学科,它使遗传工程进一步将人工合成的材料从原材料引入生物体。

如果将来自另一物种的遗传物质添加到某生物体中,则所得生物称为转基因生物。如果使用来自相同物种的遗传物质或可以与宿主自然繁殖的物种,则称为同源基因改造[8]遗传工程也可以用于从目标生物体去除遗传物质,创建一个基因敲除生物体[9]在欧洲,遗传修饰是遗传工程的同义词,而在美国,“基因修饰”一词也可以指常规的育种方法。[10][11]加拿大的监管制度是基于产品是否具有新颖的特征,而不管来源的方法。换句话说,如果产品携带一些先前在物种中未发现的性状,则其被调节为遗传修饰,无论其是使用传统育种方法(例如选择育种,细胞融合,突变育种)还是遗传工程产生的。在科学界,“基因工程”这个术语并不常用。取而代之的是更为具体的术语,例如“转基因”。

历史

数千年来,人类通过选择性育种或人工选择。近年来,逐渐通过诱变改变了物种的基因组。而遗传工程作为直接操纵DNA、由人外部育种和突变是自20世纪70年代产生的。

“遗传工程”这个术语最早由杰克·威廉姆森在1951年——也就是DNA在在遗传中的作用得到了阿弗雷德·赫希和玛莎·蔡斯的证实的前一年——出版的科幻小说“龙之岛[17]中创作。1953年,詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克里克发现DNA分子具有双螺旋结构。斯丹利·温鲍姆的1936年的科幻故事普罗透斯岛(Proteus Island)中探索了直接遗传操作的一般概念。

1972年,保罗·伯格通过将来自猴病毒SV40的DNA与λ病毒的DNA结合而产生了第一个重组DNA分子。[18]在1973年,赫伯特·博耶和斯坦利·科恩通过将抗生素抗性基因插入到大肠杆菌细菌的质粒中而产生了第一个转基因生物。一年后,鲁道夫·耶尼施通过将外来DNA引入其胚胎中创建了一种转基因小鼠,使其成为世界上第一个转基因动物[21]这些成就导致了科学界对基因工程的潜在风险的关注,这些问题首先在1975年的阿西洛马会议上进行了深入讨论。这次会议的主要建议之一是,在技术的安全性得到确认之前政府应加强对重组DNA研究的监督。1976年,赫伯特·博耶和罗伯特·史旺森创立了遗传工程公司基因泰克(Genentech),该公司在大肠杆菌中生产了人类蛋白生长抑素。 基因泰克在1978年宣布生产转基因生产的人胰岛素。1980年,美国最高法院在Diamond诉Chakrabarty案中裁定,遗传改变的生命可以获得专利。此种借由细菌生产的胰岛素以“优泌林”作为品牌名称,在1982年经美国食品药物监督管理局批准销售。[26]

丁香假单胞菌

在20世纪70年代,威斯康辛大学麦迪逊分校的研究生史蒂文·林多(Steven Lindow)与D.C.阿尔尼(D.C.Arny)和C.韦瑟(C.Weather)发现了一种细菌,它被认为是在冰成核过程中发挥作用的丁香假单胞菌,并在1977年发现了一种突变的减冰细菌。 林多博士(现在是加州大学伯克利分校的植物病理学家)后来成功创建了一个重组减冰细菌。[27]1983年,一家生物技术公司先进遗传科学公司(Advanced Genetic Sciences,AGS)申请美国政府授权,使用丁香假单胞菌的减冰菌菌株进行田间试验,以保护作物免受霜冻,但环境组织和抗议者通过法律挑战推迟了此项田间试验四年。[28] 1987年,随着加利福尼亚的草莓田和马铃薯田的喷雾,丁香假单胞菌的减冰菌菌株成为第一个被释放到环境中的转基因生物[29]这两块测试田在测试开始前一天晚上都遭到活动家团体攻击:“世界上第一的试验田吸引了世界第一的捣蛋鬼”。[29]

1986年在法国和美国进行了转基因植物的第一次田间试验,实验植物为一种抗除草剂的转基因烟草。[30]中华人民共和国是第一个将转基因植物商业化的国家,1992年引入了抗病毒的烟草。[31] 在1994年,佳基因公司(Calgene)获批将Flavr Savr番茄(一种具有较长的保质期的转基因番茄)投入市场,[32]同年欧盟批准转基因抗除草剂溴苯腈烟草,使其成为在欧洲商业化的第一个转基因作物。[33]1995年,马铃薯作物Bt Potato在经美国食品药品监督管理局和美国环境保护局批准安全使用,成为美国第一个批准的抗虫转基因作物。[34]

2009年,11个转基因作物在25个国家商业化生产,主要为美国、巴西、阿根廷、印度、加拿大、中国、巴拉圭和南非。

2010年,克莱格·凡特研究所的科学家创建了第一个合成基因组并将其插入空的细菌细胞。得到的细菌,名为“辛西娅”(Synthia),可以复制和产生蛋白质。[36][37]在2014年,开发了一种细菌,其复制含有独特碱基对(非腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤)的质粒,是首个使用扩展遗传字母表的生物体。


操作与步骤

肯尼亚人在检查经过具有抗虫害基因转移的玉米

如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片段连接到另外一种生物的DNA链上去,将DNA重新组织一下,就可以按照人类的愿望,设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型,这基因工程一般包括以下四个步骤:

获取匹配要求的DNA片段;

构建基因的表达载体;

将目的基因导入受体细胞;

目的基因的检测与鉴定。

获取匹配要求的DNA片段

第一步是选择并分离将被插入到遗传修饰的生物体中的基因。要把目的基因从供体DNA长链准确地剪切下来,可不是一件容易的事。1968年,沃纳·阿尔伯、丹尼尔·内森斯和汉密尔顿·史密斯第一次从大肠杆菌中提取出了限制性核酸内切酶,它能够在DNA上寻找特定的“切点”,认准后将DNA分子的双链交错地切断。[40]人们把这种限制性内切酶称为“分子剪刀”。这种“分子剪刀”可以完整地切下个别基因。自1970年代以来,人们已经分离提取了400多种“分子剪刀”。[41]有了形形色色的“分子剪刀”,人们就可以随心所欲地进行DNA分子长链的切割了。可以使用限制酶分离基因以将DNA切割成片段并进行凝胶电泳,以根据长度将它们分离出来。[42]聚合酶链反应(PCR)也可以用于扩增基因区块,然后可以通过凝胶电泳分离。[43] 如果所选择的基因或供体生物体的基因组已经被充分研究,它可以存在于基因库中。如果DNA序列已知,但没有该基因的拷贝可用,则可以人工合成。[44]

要插入遗传修饰的生物体中的基因必须与其它遗传组件组合以使其正常工作。还可以在该阶段修饰基因以更好地表达或有效性。除了要插入的基因之外,大多数构建体含有启动子和终止子区以及选择标记基因。启动子区启动基因的转录,并且可以用于控制基因表达的位置和水平,而终止子区终止转录。[45] 在大多数情况下赋予其在其中表达的生物体抗生素抗性的选择性标记,需要确定哪些细胞用新基因转化。

构建基因表达载体

DNA的分子链被切开后,还得缝接起来以完成基因的拼接。1967年,科学家们在5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶,这种酶可以将两个DNA片段连接起来,修复好DNA链的断裂口。[46]1974年以后科学界正式肯定了这一发现,并把这种酶叫作DNA连接酶。[41]从此,DNA连接酶就成了名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种DNA碎片中加上“分子针线”,就会把两种DNA片段重新连接起来。

质粒载体

DNA的操作通常发生在质粒内。使用重组DNA技术,例如限制性消化,连接和分子克隆制备构建体。[47] 其中一种常见的技术是将新的遗传物质插入宿主基因组中的特定位置,或在所需的能够敲除的基因组位点产生突变内源基因。基因靶向技术使用同源重组来靶向特定内源基因的期望变化。这在植物和动物中发生的频率相对较低,并且通常需要使用选择标记基因。使用工程化核酸酶如锌指核酸酶,[48][49]工程改造的归巢核酸内切酶(或“兆碱基”)[50][51]或由TAL效应物产生的核酸酶,[52][53]可以大大增强基因靶向的频率。 除了增强基因靶向,工程化核酸酶也可以用于在产生基因敲除的内源基因中引入突变。[54][55]

病毒载体

主条目:病毒载体

病毒载体是一种常用的工具,可将遗传物质带入细胞。可发生于完整活体或是细胞培养中。原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞,进行感染的分子机制。[56]

慢病毒载体是病毒载体中的一种在慢病毒基础上发展起来的基因工程载体。慢病毒基因组不需要靶细胞分裂即可集成到细胞核中。来源于慢病毒的载体也体现了能够稳定地转导分裂和非分裂细胞(包括干细胞)这一优势。[57]慢病毒载体当前已发展成为一个强大的基因转移工具,广泛应用于生物学研究和基因治疗。慢病毒载体构建时,病毒的顺式作用组件(非编码所需的转录、反转录和包装元素)必须与反式作用组件(酶、结构和辅助蛋白编码)序列分离,以防止形成具有复制能力的慢病毒颗粒(RCL)。[58]

将目的基因导入受体细胞

主条目:转化 (生物)

只有约1%的细菌天然能够摄取外源DNA。然而,这种能力可以通过外部刺激(例如热或电击)诱导其他细菌产生,增加其细胞膜对DNA的通透性;已吸收的DNA可以与基因组集成或作为染色体外DNA(如质粒)存在。 DNA通常使用显微注射插入动物细胞,其中它可以通过细胞的核膜直接注射到细胞核中或通过使用病毒载体。[59]在植物中,通常使用农杆菌介导的重组或基因枪技术(biolistics)插入DNA。[60]

在农杆菌介导的重组中,质粒构建体含有T-DNA,其负责将DNA插入宿主植物基因组中。在感染植物细胞之前,将该质粒转化到不含质粒的农杆菌中。然后农杆菌将天然地将遗传物质插入植物细胞中。[61]在生物动力学中,金或钨的颗粒用DNA包被,然后注射到愈伤组织细胞或植物胚胎中。一些遗传物质将进入细胞并转化它们。该方法可以用于不易受农杆菌感染的植物上,并且还允许植物质体的转化。用于植物和动物细胞的另一种转化方法是电穿孔。电穿孔包括使植物或动物细胞遭受电击,其可使细胞膜对质粒DNA可透过,在一些情况下,电穿孔细胞可将DNA掺入其基因组中。由于其对细胞和DNA的损害,基因枪和电穿孔的转化效率低于农杆菌介导的转化和显微注射。[62]

由于用于转化的细胞通常只有一个,因此必须将该单个细胞培育成生物体。细菌由单个细胞组成并且不需要克隆再生。在植物中,这通过使用组织培养来实现。每种植物对通过组织培养成功再生具有不同的要求。如果成功,则产生在每个细胞中含有转基因的成年植物。在动物中,有必要确保插入的DNA存在于胚胎干细胞中。

目的基因的检测与鉴定

排序基因的专用计算机


选择标记用于区分转化的和未转化的细胞。这些标记通常存在于转基因生物体中,尽管已经开发了可以从成熟转基因植物中除去选择性标记的多种策略。[63] 当产生后代时,可以筛选基因的存在。来自第一代的所有后代对于插入的基因将是杂合的,并且必须交配在一起以产生纯合动物。

进一步的测试使用PCR,南方墨点法(Southern印迹),并且进行DNA测序以确认生物体含有新基因。即将转基因生物的基因组DNA提取出来,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,就表明目的基因已插入染色体DNA中。该方法因发现者而命名为南方墨点法。这些测试还可以确认插入基因的染色体位置和拷贝数。基因的存在并不保证其在靶组织中以适当的水平表达,因此也使用寻找和测量基因产物(RNA和蛋白质)的方法。这些包括北方墨点法(Northern印迹),定量即时聚合酶链锁反应(RT-PCR),西方墨点法,免疫荧光,酵素免疫分析法(ELISA)和表型分析。为了稳定转化,该基因应以孟德尔遗传模式传递给后代,因此也应研究该生物的子代。


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